Содержание
- этапы
- Метод 1 из 3: Определите бактерию по окраске по Граму
- Метод 2 из 2: Проведите тест на окрашивание Циля-Нильсена
- Метод 3 из 3: Изучите поведение и внешний вид бактерий
- Метод 4 из 3: интерпретировать все результаты
Идентификация бактерий является сложной задачей. Одна из причин заключается в том, что, по оценкам, в мире насчитывается от 10 000 до 1 миллиарда видов бактерий! Правильная идентификация бактерий очень важна, особенно в области медицины, где правильное лечение заболевания во многом зависит от типа микроба, который вызывает проблему. В большинстве случаев идентификация производится на основе исключения. Чтобы идентифицировать бактерию, вы должны выполнить тесты на окрашивание, проанализировать ее внешний вид и наблюдать, как она хорошо реагирует на различные условия. Если вам нужен быстрый результат, возьмите образец ДНК и отправьте в лабораторию.
этапы
Метод 1 из 3: Определите бактерию по окраске по Граму
- определить если бактерии грамположительные или отрицательные. Окрашивание по Граму - это метод разделения бактерий между двумя наиболее распространенными типами: грамположительным и грамотрицательным. Первые имеют толстую клеточную стенку, состоящую из полимера, называемого пептидогликан, который лучше всего окрашивается в виде тонких стенок грамотрицательных бактерий.
- Некоторыми распространенными типами грамположительных бактерий являются стрептококки, стафилококки, микрококки (или микрококки) и листерии.
- Вот некоторые распространенные примеры грамотрицательных бактерий: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium и Campylobacter.
- Принять соответствующие защитные меры. Бактерии и химические элементы, которые вы будете использовать во время теста, представляют опасность для вашего здоровья. При проведении теста на окрашивание наденьте защитные очки, одноразовые нитриловые перчатки и лабораторный халат. Когда вы закончите, положите перчатки и все другие загрязненные материалы в специальную сумку. Не забудьте следовать процедурам вашей лаборатории, чтобы избавиться от пакета для загрязненных продуктов.
- Положите образец для наблюдения на предметное стекло. Чтобы начать тестирование, поместите каплю или бактериальный образец на стерильное предметное стекло. Затем наденьте лезвие на горелку Бунзена, зажженную три раза, чтобы зафиксировать образец и не допустить его выпадения из пластины при полоскании или добавлении реагентов.
- Добавьте 5 капель фиолетового кристалла на клинок. Вылейте пять капель раствора кристаллического фиолетового на образец. Подождите минуту, чтобы образец поглотил кристаллический фиолетовый.
- Держите лезвие на месте прищепками, чтобы не испачкать руки.
- Тщательно вымойте лезвие, чтобы удалить пятно. Используйте кран или отжимную бутылку и дайте воде очень медленно течь в течение пяти секунд, чтобы удалить остатки чернил, которые не прилипли к образцу.
- Вылейте пять капель окраски грамм-диода на предметное стекло. Это раствор, состоящий из диода, бикарбоната натрия и диодида калия, который вызывает плавление кристаллического фиолетового с клеточными стенками бактерий. Вылейте пять капель раствора на образец и оставьте на одну минуту.
- Вымойте образец спиртом или молочной кислотой. Алкоголь и лактон являются отбеливающими веществами и устранят окрашивание бактериальных клеточных стенок, если они являются грамотрицательными. Налейте несколько капель отбеливателя на образец и дайте ему поработать не более трех секунд. После этого попробуйте осторожно промыть водой в течение пяти секунд, чтобы удалить эти отбеливающие вещества.
- Если вы позволите отбеливателю работать в течение длительного времени, это может привести к исчезновению окрашивания грамположительных бактерий, что приведет к ложному отрицательному результату.
- Выполните контрастный тест с сафранином. Сафранин - красный краситель, который контрастирует с кристаллическим фиолетовым, таким образом окрашивая бактерии, не затронутые фиолетовым окрашиванием. Вылейте приблизительно пять капель сафранина на образец и оставьте на одну минуту. После этого попробуйте осторожно промыть водой в течение пяти секунд.
- Визуализируйте ваш образец при увеличении в 1000 раз. Бактерия станет пурпурной или пурпурной, если она грамположительна, или розовой, если она грамотрицательна из-за сафранина.
Метод 2 из 2: Проведите тест на окрашивание Циля-Нильсена
- Используйте эту технику для обнаружения кислотоустойчивых бактерий. Эти виды содержат большее количество липидов, что делает их более устойчивыми к красителям, используемым при окрашивании по Граму. Кислотоустойчивые бактерии относятся к роду Mycobacterium, в состав которого входит бактерия, ответственная за туберкулез (M. tuberculosis). Для окрашивания кислотоустойчивой бактерии необходимо использовать красный краситель под названием карболический фуксин, устойчивый к полосканию растворами кислой или серной кислоты.
- Принять соответствующие защитные меры. Химические и биологические материалы, используемые во время окрашивания Циля-Нильсена, могут быть опасными. Кроме того, вам также понадобится использовать источники тепла, такие как сопло Бунзена, электрический нагреватель или спиртовую лампу. Следуйте инструкциям ниже, чтобы выполнить тест.
- Наденьте защитные очки, нитриловые перчатки и лабораторный халат.
- Будьте осторожны, не вдыхайте пары от красителей и отбеливателей и не допускайте попадания капель на глаза или кожу. Держите контейнеры открытыми под капотом.
- Будьте очень осторожны при нагревании лезвия. Большинство используемых химикатов являются легковоспламеняющимися. Также могут быть следы горючих веществ на предметных стеклах или другом оборудовании.
- Подготовь клинок. Круговыми движениями равномерно распределите небольшое количество бактериального образца в центре стерильного предметного стекла. Ваш образец должен занимать около 10 мм на 20 мм.
- Вытри лезвие Поместите лезвие на сушильную конструкцию так, чтобы образец был направлен вверх. Дайте ему высохнуть естественным путем в течение 30 секунд. Не пытайтесь высушить лезвие тканью.
- Закрепите образец теплом. Подняв образец, сдвиньте лезвие два или три раза над зажженной горелкой Бунзена. Вы также можете разместить лезвие на электронагревателе, установив температуру от 65 ° C до 75 ° C как минимум на два часа. Будьте осторожны, чтобы не кипятить и не сжигать образец.
- Добавьте карболический фуксин к лезвию. Налейте несколько капель этого раствора на предметное стекло. Залейте достаточно, чтобы полностью покрыть образец.
- Нагрейте лезвие, чтобы зафиксировать краситель. Осторожно нагрейте предметное стекло над горелкой Бунзена или спиртовой лампой, направив образец вверх, или поместите его на электрический нагреватель. Нагрейте лезвие до 60 ° C или пока оно не начнет выпускать пар. Позвольте красителю действовать в течение пяти минут.
- Если вы используете электрический нагреватель, включите его при температуре 60 ° C. Если вы выберете алкогольную лампу или горелку Бунзена, вам следует ожидать появления паров.
- Чтобы поддерживать лезвие при желаемой температуре в течение пяти минут, периодически нагревайте его.
- Будьте осторожны, чтобы не кипятить, не сжигать и не сушить образец.
- Промойте лезвие холодной водой. Дайте ему остыть в течение пяти минут и аккуратно промойте несколько секунд чистой водой. Используйте водопроводную воду или бутыль для отжима, чтобы удалить пятна краски, которые не прилипли к образцу.
- Налить на образец кислый спирт или серную кислоту. Используйте объем 3% по объему (об. / Об.) Спирта или 20% серной кислоты, чтобы полностью покрыть образец. Позвольте кислоте работать, пока цвет не исчезнет и не достигнет очень яркого розового оттенка. Процесс обычно занимает около десяти минут.
- Используйте чистую воду, чтобы промыть лезвие. Осторожно промойте лезвие под краном или с помощью отжимной бутылки. Хорошо удалите все остатки кислоты и красителей.
- Добавьте контрастное вещество. После того, как вы промыли слайд, налейте краситель малахитовый или метиленовый синий. Эти два раствора создают голубоватый или зеленоватый фон, на котором появится красный краситель, а также другие биологические материалы, такие как клетки человека и некислотные бактерии. Пусть вещества работают в течение одной-двух минут.
- Промыть и высушить лезвие. Тщательно промойте водой, чтобы удалить лишний контраст. Как только вы закончите, высушите заднюю часть лезвия сухой тканью и дайте ему высохнуть естественным образом на подставке.
- Визуализируйте ваш образец при увеличении в 1000 раз. Кислотоустойчивые бактерии станут красными или темно-розовыми. Другие бактерии, небактериальные клетки и основание клинка станут зелеными или синими.
Метод 3 из 3: Изучите поведение и внешний вид бактерий
- Проанализируйте форму бактерий. После проведения теста на окрашивание, чтобы определить, являются ли бактерии грамположительными, грамотрицательными или кислотоустойчивыми, настало время для более точной идентификации видов. Сначала проанализируйте форму бактерий на слайде. Три наиболее распространенные формы - кокки (сферические), спирали и бациллы (форма стержня).
- Существует несколько вариантов этих форм. Например, бактерии круглой формы (кокк) могут появляться парами (диплококки), цепями, кучами или группами по четыре (тетрады).
- Узнайте, является ли бактерия аэробной или анаэробной. Возьмите два образца бактерий и создайте две отдельные культуры. Луна должна быть анаэробной (выращенной без кислорода), а другая должна быть аэробной (выращенной с кислородом). Храните анаэробную культуру при температуре 35 ° C в бескислородном месте не менее 48 часов, прежде чем наблюдать рост.
- Если бактерии растут в среде без кислорода, но не под воздействием кислорода, это означает, что они являются анаэробными.
- Хотя они развиваются в оксигенированной среде, но не в отсутствие кислорода, они являются аэробными.
- Когда они развиваются в обеих средах, мы говорим о факультативных анаэробных бактериях.
- Выполните тест на моторику. Бактерия подвижна, если она может двигаться одна с одним или несколькими жгутиками. Степень подвижности очень важна для идентификации определенных видов бактерий. Существует несколько типов подвижности, но самый безопасный и разборчивый способ - полутвердая среда.
- Создать культуру для теста на моторику. Готовят культуру бактерий в культуральном бульоне. Следуйте инструкциям ниже, чтобы приготовить бульон на ваш выбор.
- Инокулировать культуру в полутвердом агаре для тестов на подвижность. Покройте часть бульонной культуры стерильной инокуляционной иглой. Осторожно посадите иглу в полутвердую трубку Дагара, например, TTC Lagar, которую вы подготовили для теста. Игла должна проникнуть в 2/3 агара.
- Когда вы закончите, осторожно извлеките иглу, стараясь не превышать пределы зоны инокуляции.
- Инкубируйте пробирку при 30 ° С в течение 48 часов.
- Прочитайте результат теста. Агар для теста на подвижность станет красным при контакте с бактериями. Если они подвижны, этот красный или розоватый оттенок будет распространяться по всему веществу. В противном случае окрашивание будет ограничено местом инъекции.
Метод 4 из 3: интерпретировать все результаты
- Соберите ваши комментарии. Чтобы узнать тип бактерий, вам необходимо собрать информацию, полученную из культур, тестов на окраску и наблюдения за формами. Если вы исследуете образцы пациента, симптомы, которые они представляют, могут также помочь определить тип бактерий, который подходит.
- Например, если тесты показывают, что бактерии являются грамотрицательными, анаэробными, неподвижными и вы замечаете такие симптомы, как боль в животе, тошнота и рвота у пациента, вполне вероятно, что пациент страдает бактериальной инфекцией. ломкие.
- Обратитесь к базе данных. В мире тысячи видов бактерий. Невозможно знать все наизусть. Скорее всего, вам нужно будет обратиться к книге по клинической микробиологии или онлайн-базе данных, чтобы сравнить результаты теста с информацией о видах бактерий.
- Существуют отличные интернет-ресурсы для идентификации бактерий, но большинство этих баз данных доступны на английском языке, включая Patricbrc.org и GlobalRPh. Тем не менее, вы все равно можете найти полезную информацию на веб-сайте Международного центра микробных ресурсов INRA.
- Сделайте генетический тест, чтобы узнать точные виды бактерий. В некоторых случаях вам может потребоваться определить виды бактерий. Самый быстрый и простой способ - провести анализ ДНК. ДНК-тесты также полезны для выявления бактерий, устойчивых к традиционным формам окрашивания и культивирования. В настоящее время анализы ДНК на микроорганизмы очень быстрые и могут быть готовы менее чем за два часа.
- Если у вас нет доступа к лаборатории, которая выполняет генетическое секвенирование микроорганизмов, отправьте бактериальный образец в специализированное учреждение.